EGFR-TKI耐药突变(32)：东亚人群中非小细胞肺癌

本文来源：中华医学杂志, 2018, 98(32) : 2544-2551.

表皮生长因子受体（EGFR）基因突变是东亚人群非小细胞肺癌（）中最常见的驱动基因突变，发生率为30%~40%。先前的几项研究支持EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（TKI）单药治疗是局部晚期或转移性EGFR基因突变患者的标准治疗，但大多数患者在治疗后9至14个月会出现耐药性。其中，EGFR基因第20外显子的错义突变（即突变）是最重要的耐药突变类型。报道的EGFR-TKI耐药后组织样本的突变阳性率基本在60%左右，不同技术方法的检测结果比较相似，但血浆样本的突变阳性率因方法不同差异很大，

奥希替尼是一种口服、强效、不可逆的第三代 EGFR-TKI，具有中枢神经系统活性，可选择性抑制 EGFR 敏感突变和突变。发生。一项随机 III 期临床研究比较了奥希替尼和铂类双药化疗对一线 EGFR-TKI 耐药后晚期组织阳性疾病患者的疗效。结果表明，与标准化疗相比，奥希替尼可显着延长中位进展生存期（PFS）。II 期、开放标签、单臂、中国注册的临床研究证明了奥希替尼在 EGFR-TKI 耐药后组织突变阳性的亚太地区和中国人群中的疗效，客观缓解率 (ORR) 为 63%，中位 PFS 9.7 个月。基于以上研究，奥希替尼于2017年3月22日获得中国食品药品监督管理总局（CFDA）批准用于既往EGFR-TKI治疗期间或之后的疾病进展，并通过检测证实存在EGFR突变。治疗阳性的局部晚期或转移性成年患者。目前，美国国家综合癌症网络（NCCN）、欧洲临床肿瘤学会（ESMO）指南、中国临床肿瘤学会（CSCO）原发性肺癌诊治指南均推荐奥希替尼用于局部晚期或转移性EGFR- TKI 耐药。突变阳性患者的标准治疗。治疗阳性的局部晚期或转移性成年患者。目前，美国国家综合癌症网络（NCCN）、欧洲临床肿瘤学会（ESMO）指南、中国临床肿瘤学会（CSCO）原发性肺癌诊治指南均推荐奥希替尼用于局部晚期或转移性EGFR- TKI 耐药。突变阳性患者的标准治疗。治疗阳性的局部晚期或转移性成年患者。目前，美国国家综合癌症网络（NCCN）、欧洲临床肿瘤学会（ESMO）指南、中国临床肿瘤学会（CSCO）原发性肺癌诊治指南均推荐奥希替尼用于局部晚期或转移性EGFR- TKI 耐药。突变阳性患者的标准治疗。

EGFR突变的检测对于晚期EGFR-TKI耐药患者的后续治疗具有重要的临床指导意义，但我国在这方面尚未达成共识。应该推荐谁进行测试？如何把握检测时机？如何选择测试样品？不同类型的样本在材料的选择和应用、固定和检测技术上应该如何标准化？这些临床试验实践问题亟待解决。

共识建立方法

该工作得到CSCO肿瘤生物标志物专家委员会的支持，以广东省人民医院吴一龙教授为首，成立了共识撰写专家组，组织国内相关领域的临床和病理专家进行中国EGFR基因突变的临床检测。耐心。在已有专家广泛认可的高质量循证医学证据和临床经验的基础上，参考国内外最新相关指南，为规范国内临床检测实践，达成以下专家共识。

本共识中的建议基于高质量的国内外文献。共识撰写时，专家组对相关文献进行了系统检索和分析，使用关键词“非小细胞肺癌/非细胞肺/”、“获得性耐药/”、“”、“生物标志物/ "等在公共数据库中进行了文献检索，例如 .

表示共识专家组成员之间存在重大差异。除少数特殊说明外，本共识推荐的证据水平高于 2A 类。

形成共识

(一) EGFR基因突变检测人群及检测时机

【共识1】 建议既往接受过EGFR-TKI治疗的局部晚期或转移性疾病患者在疾病进展后进行EGFR突变检测，建议在影像学进展后考虑检测（1类）。

对EGFR-TKI治疗耐药的患者的突变率约为60%。奥希替尼是各种权威指南推荐的此类突变阳性患者的标准治疗方法。为了让患者尽可能从最有效的治疗中获益，应尽可能对所有既往接受过 EGFR-TKI 治疗的局部晚期或转移性疾病患者进行突变检测。

多项动态血浆监测研究表明，突变发生早于实体瘤反应评价标准评估的影像学进展，但仍需更多研究探索使用三代在之前检测到耐药突变的患者成像进展。EGFR-TKI是否能获益更多。研究结果显示，在第一代EGFR-TKI吉非替尼治疗后出现影像学进展的EGFR突变阳性晚期突变阳性患者继续接受吉非替尼联合顺铂和培美曲塞化疗，与安慰剂联合化疗相比，总生存期明显增加。 OS) 严重损坏。提示第一代EGFR-TKI治疗后影像学进展阳性的患者继续第一代EGFR-TKI治疗可能会受到伤害。因此，在临床实践中，建议在接受EGFR-TKI治疗后和影像学进展出现标准评估后进行检测，以指导患者后续的治疗选择。

(二)EGFR基因突变检测样本

【共识2】建议首先评估患者是否可以进行组织活检。如果组织可用，建议先取组织进行突变检测。推荐的检测路径如图1（1类）所示。

注意：a 如果没有组织，也可以使用细胞学样本代替

▲图1 基因突变检测路线推荐

国内外权威指南和共识建议优先考虑突变检测机构。2017 NCCN V9指南建议，接受吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼等第一代或第二代EGFR-TKI治疗后出现耐药的患者，应及时进行突变检测，并优先考虑组织检测。如果组织活检不及时，则考虑血浆试验。如果血浆检测为阴性，建议再次进行组织检测；2017年CSCO指南还指出，“对于EGFR-TKI耐药的病例，推荐二次活检进行二次耐药EGFR检测（ARMS法，批准的试剂盒）；血浆EGFR检测适用于组织无法检测的患者。获得。”

目前肿瘤组织仍是耐药性检测的首选样本。除了分子检测外，组织形态学改变如转化为小细胞肺癌（SCLC）只能通过组织活检来诊断。多项研究报告称，50% 至 80% 的耐药患者可以接受第二次活检。根据不同的方法，肺癌患者的小组织样本可分为经支气管取样和经皮肺活检。其中，支气管内超声引导下活检可有效将气胸和出血的发生率控制在2%以下。其他小样本活检的具体要求及注意事项请参见《中国肺癌小样本采集相关问题专家共识》。

【共识3】当无法获取组织时，可考虑肿瘤细胞学样本或血浆样本等其他样本进行EGFR检测（2A类）。

肺癌细胞学样本可通过支气管肺泡灌洗或胸水、痰液、脑脊液等获得。利用胸水检测EGFR基因突变具有较高的敏感性和特异性，与利用胸水或腹水检测EGFR基因突变具有相似的特点。与组织相比，阳性率和一致性极高。EGFR基因突变检测共识推荐使用细胞学样本。2017年，美国病理学家协会（CAP）、国际肺癌研究协会（）和美国分子病理学会（AMP）联合更新的分子检测指南建议病理学家可以使用细胞团块或其他细胞学标本作为肺癌的分子检测。合适的标本。

细胞学样本也适用于 EGFR 突变检测。研究报道，既往接受过EGFR-TKI治疗的EGFR突变阳性患者的组织学和细胞学样本的突变一致性达到91.7%。无论使用哪种类型的标本，都应包含足够的肿瘤细胞（推荐肿瘤细胞数量为200个以上），并尽量排除非肿瘤组织和细胞。

对于无法获得组织或细胞学样本的患者，也可以采集血液样本、脑脊液或尿液样本进行 EGFR 突变检测。EGFR-TKI耐药后的血浆突变阳性患者和肿瘤组织阳性患者与奥希替尼治疗具有相似的临床获益，推荐在无法获得肿瘤组织时作为首选样本。尿液样本也用于检测，尿液阳性患者在接受第三代 EGFR-TKI 治疗后与组织阳性患者具有相似的 ORR 和中位 PFS。

【共识4】对于血浆检测阴性的患者，建议密切关注患者疾病状态，重新评估组织活检的可行性，并酌情重新检测组织或其他样本中的EGFR（2A类）。

此前多项关于奥希替尼的ARUA系列注册临床研究报道，血浆阴性但组织呈阳性的患者在接受奥希替尼治疗后仍有较高的ORR（62%至70%）。AURA 研究中的血浆样本使用高度敏感的数字 PCR 方法进行了突变检测，104 名血浆检测阴性的患者中有 47 名的组织样本检测为阳性。这些患者的 ORR (69% vs. 25%) 和平均 PFS (1<@@@6.5 vs 2.8 个月) 显着高于血浆和组织样本阴性的患者。对该研究的基线血浆样本的回顾性分析显示，组织阳性患者的血浆中有 23% 至 27% 无法检测到 EGFR。进一步分析发现，释放与肿瘤大小相关，

(三)EGFR基因突变检测方法

【共识5】针对不同的样本类型和临床需求，推荐不同的检测方法。建议使用灵敏度更高的方法检测血浆样品（2A 类）。

当可以获得肿瘤组织时，主要使用甲醛固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织样本进行临床检测。推荐使用ARMS方法（检测阈值可以达到1%）。目前，市场上有许多基于这种技术的商业组织。EGFR基因突变检测试剂盒已获得CFDA批准，可用于检测。其中，基于ARMS EGFR突变检测试剂盒（®EGFR Test V2)）作为奥希替尼临床注册研究入组患者的检测方法，作为配套获得FDA批准2016年诊断奥希替尼，2018年6月获得国内CFDA批准。该突变是由EGFR基因第20外显子第2369位C>T碱基突变引起的。在 FFPE 样品制备过程中，甲醛固定会导致 DNA 脱氨。，胞嘧啶和 5-甲基胞嘧啶分别脱氨基为尿嘧啶和胸腺嘧啶，导致丰度非常低的 C>T 碱基突变。当使用接近0.1%的检测阈值检测FFPE样本时，可能会产生假阳性，因此在使用高灵敏度检测技术时，建议使用胸苷DNA糖基化酶对FFPE提取的DNA样本进行预处理去除脱氨基形成的尿嘧啶和胸腺嘧啶，并使用经过验证和合理的检测。组织突变阳性的阈值。当使用接近0.1%的检测阈值检测FFPE样本时，可能会产生假阳性，因此在使用高灵敏度检测技术时，建议使用胸苷DNA糖基化酶对FFPE提取的DNA样本进行预处理去除脱氨基形成的尿嘧啶和胸腺嘧啶，并使用经过验证和合理的检测。组织突变阳性的阈值。当使用接近0.1%的检测阈值检测FFPE样本时，可能会产生假阳性，因此在使用高灵敏度检测技术时，建议使用胸苷DNA糖基化酶对FFPE提取的DNA样本进行预处理去除脱氨基形成的尿嘧啶和胸腺嘧啶，并使用经过验证和合理的检测。组织突变阳性的阈值。

对于组织不可用的患者，细胞学或血浆样本可用于突变检测。低丰度和小片段的特点对检测平台提出了更高的要求，建议使用灵敏度更高的方法进行检测。以组织为参照，™ EGFR突变检测试剂盒、® EGFR突变检测试剂盒V2、厦门爱德-ARMS®人EGFR突变检测试剂盒等ARMS的血浆检测灵敏度分别为29%、41%~64%和 49% 到 61%。2018年1月19日，CFDA批准-ARMS法产品用于血液中EGFR基因突变（含）检测，作为组织样本难以获取时的补充手段。以组织为参考，不同数字PCR平台的灵敏度（检测阈值可达到< @0.1%）分别为 71%（数字 PCR）、56%-71%（Bole 微滴数字 PCR，™）和 69%（ ™ 3D 数字 PCR），同时比较多种检测方法的研究均表明数字 PCR 方法比普通的 ARMS 方法更灵敏。不同研究报告中二代测序（NGS）技术检测血液的阳性率差异很大（16.8%～54.0%）。在一定的测序覆盖深度（有效深度大于1 000次，检测阈值0.1%）下，NGS血液检测基于组织的灵敏度为65%~71%，可以也适用于中等突变的检测。但由于不同的实验室使用不同的NGS平台、操作程序、测序深度、生物信息学解读标准，可能导致检测灵敏度不同，在选择NGS进行检测时应充分注意NGS技术参数。基于数字PCR和NGS的EGFR检测平台也在CFDA申请过程中，未来会有更多的临床应用选择。

(四)EGFR基因突变检测流程

【共识6】从事EGFR突变检测的实验室和技术人员应具备相关资质和证书（1类）。

开展EGFR突变检测的实验室必须建立PCR标准实验室，通过国内外相关机构的认证，符合中国健康管理机构和国际质量标准，定期参与国内PQCC、国外EMQN等相关技术的质量控制项目等。室内质量评估项目。检测人员应经过严格的上岗培训，取得相关PCR上岗证书，精通检测技术，严格按照标准操作规程操作。

【共识7】申请EGFR突变检测时，建议提供既往用药史、既往EGFR检测史等信息（2A类）。

检测前，临床医师发起检查申请并填写检查表。除患者基本信息外，建议提交表包括样本采集信息（肿瘤组织采集部位、采集时间等）、患者治疗史（包括是否进行过EGFR-TKI治疗，如果所以建议提供用药的起止时间、疾病进展时间、疾病转移、是否接受放化疗、起止时间等疾病信息和既往EGFR检测史（如有） ，包括样品类型、检测方法、检测时间和结果）。填写规范，

【共识8】为保证EGFR突变检测的成功率和检测结果的正确性，需要对样本预处理和检测进行严格的质量控制（1类）。

不同类型样品的处理要求见表1。

表 1 不同类型样品的处理及要求

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处理/请求

组织样本

细胞学样本

血液样本

采样/固定要求

体外 30 分钟内固定

手术样本在 4% 中性甲醛中的固定时间为 6 至 48 小时；对于活检样本，固定时间为 6 至 12 小时。对有骨转移的患者进行取样时，应注意对有转移灶的软组织成分进行活检，尽可能采用温和的EDTA方法（ 2A）

胸水 20-500 ml：用肝素抗凝 痰和支气管肺泡灌洗液：收集和处理前 4°C 保存 细胞学细胞涂片用 95% 乙醇固定液，时间不少于 15 分钟，必要时细胞学样品蜡块，固定4%中性甲醛，后续操作可参照小活检标本要求（2A类）

血样需要小心防止溶血。使用 EDTA 抗凝管在室温下两小时内分离血浆。使用常温采血管（或BCT管）常温保存3~7天，但建议尽快分离检测（2A类）

要求

使用常见的 ARMS 方法时，建议使用 >200 个肿瘤细胞（当使用更敏感的技术并且检测得到充分验证时，可以使用更少的细胞）

不同的技术平台对血量有不同的要求，通常推荐10ml全血（2A类）

当肿瘤细胞比例大于等于10%时，可直接检测；当检测到肿瘤细胞时，需要在显微镜下仔细富集（2A类）

DNA/血浆游离 DNA 提取和定量

对于从组织 FFPE 样本或血浆样本中提取 DNA，建议使用专门用于 FFPE 样本或样本的经过验证的提取试剂盒。大多数常见的DNA提取试剂盒对血浆样品中小片段的回收率很低，因此血浆检测应选择小片段回收率高的提取试剂盒，并且最好将浓度进一步浓缩，这样可以有效提高检测灵敏度（1类）。)

提取后对组织DNA或血浆进行定量，严格控制质量。当DNA/样本量不足或质量不合格时，不应继续检测，应重新提取或重新取样（2A类）

检测控制设置和结果解释

应设置相关的野生型DNA阴性对照和突变阳性对照。如发现阴性对照和/或阳性对照异常，或任一检测环节未通过质控，应进行复检。检测结果为阳性时，如果难以判断样品检测结果是否落在阈值附近，建议采用其他方法进行复检确认，或在检测报告和报告中填写相关内容交给临床医生；检测结果为阴性时，需排除因DNA样本质量问题及其他实验操作问题造成的假阴性，填写检测报告的相关内容，上报临床医生；尤其是当血样检测呈阴性时，

建议在血液检测中包括 EGFR 敏感突变作为参考。EGFR突变阳性患者在EGFR-TKI治疗进展后，如果无法检测到原有的EGFR敏感突变，则可能表明量不足或未在血浆中释放。假阴性结果，建议重新测试以确认状态（2A类）

注：EDTA：乙二胺四乙酸、血液抗凝剂等；：游离DNA

【共识9】为尽快为患者提供治疗方案，建议从收到样本到出具检测结果报告的总时间不超过7个工作日（2A类）。

【共识10】建议规范检测报告的内容，包括样品信息、检测内容、检测结果、结果解读、检测日期和签名（1类）。

检测报告的样本信息应包括样本编号、接收日期、患者信息（姓名、性别、年龄）、样本具体信息（临床诊断、初始治疗或复发、样本来源和类型、样本质量和数量） 、病理分类、质控信息）。检测内容应包括检测项目和场所、检测技术、使用的仪器和试剂、检测灵敏度和局限性等。检测结果应包括对结果的描述，如阳性、阴性或需要重新检测，对需要重新检测的样品应提供重新检测的原因。测试结果的临床意义在测试结果中显示。检测报告应由检测人员和分子病理学家签字并注明检测日期。测试报告模板可参考图2。

▲图2 EGFR基因突变检测报告模板

外表

随着检测技术的不断改进，检测灵敏度逐渐提高，使得检测血浆样本中极低水平的突变成为可能。由于液体活检的便利性和微创性，越来越广泛地应用于肿瘤发展各个阶段的检测。在研究中发现，使用等离子体动态检测可以比成像检测提前2个月检测到突变；在等人的报告中，还发现在成像进展前2个月可以在血浆中检测到突变。. 因此，血浆样本的动态检测也可用于EGFR-TKI治疗期间，提前预测EGFR-TKI治疗后的疾病进展。另一方面，在一些研究中，发现接受过初治晚期治疗的患者有原发性突变；在EGFR-TKI治疗前的晚期患者中，传统方法检测到的突变率为2%～3%。更高的原发性突变率可以通过更灵敏的检测来检测，但由于这些研究主要使用甲醛固定的肿瘤组织样本，因此在此类样本中通过超灵敏检测检测到的突变也可能是甲醛固定导致的假阳性，所以的真实突变率仍然存在争议。第一代EGFR-TKI治疗对肿瘤组织原发患者的临床获益较差，而第三代TKI治疗获益明显，因此之前未接受过EGFR-TKI治疗的晚期患者也可考虑进行检测。在EGFR-TKI治疗前的晚期患者中，传统方法检测到的突变率为2%～3%。更高的原发性突变率可以通过更灵敏的检测来检测，但由于这些研究主要使用甲醛固定的肿瘤组织样本，因此在此类样本中通过超灵敏检测检测到的突变也可能是甲醛固定导致的假阳性，所以的真实突变率仍然存在争议。第一代EGFR-TKI治疗对肿瘤组织原发患者的临床获益较差，而第三代TKI治疗获益明显，因此之前未接受过EGFR-TKI治疗的晚期患者也可考虑进行检测。在EGFR-TKI治疗前的晚期患者中，传统方法检测到的突变率为2%～3%。更高的原发性突变率可以通过更灵敏的检测来检测，但由于这些研究主要使用甲醛固定的肿瘤组织样本，因此在此类样本中通过超灵敏检测检测到的突变也可能是甲醛固定导致的假阳性，所以的真实突变率仍然存在争议。第一代EGFR-TKI治疗对肿瘤组织原发患者的临床获益较差，而第三代TKI治疗获益明显，因此之前未接受过EGFR-TKI治疗的晚期患者也可考虑进行检测。更高的原发性突变率可以通过更灵敏的检测来检测，但由于这些研究主要使用甲醛固定的肿瘤组织样本，因此在此类样本中通过超灵敏检测检测到的突变也可能是甲醛固定导致的假阳性，所以的真实突变率仍然存在争议。第一代EGFR-TKI治疗对肿瘤组织原发患者的临床获益较差，而第三代TKI治疗获益明显，因此之前未接受过EGFR-TKI治疗的晚期患者也可考虑进行检测。更高的原发性突变率可以通过更灵敏的检测来检测，但由于这些研究主要使用甲醛固定的肿瘤组织样本，因此在此类样本中通过超灵敏检测检测到的突变也可能是甲醛固定导致的假阳性，所以的真实突变率仍然存在争议。第一代EGFR-TKI治疗对肿瘤组织原发患者的临床获益较差，而第三代TKI治疗获益明显，因此之前未接受过EGFR-TKI治疗的晚期患者也可考虑进行检测。此类样本中超灵敏化验检测到的突变也有可能是甲醛固定引起的假阳性，因此的真突变率仍有争议。第一代EGFR-TKI治疗对肿瘤组织原发患者的临床获益较差，而第三代TKI治疗获益明显，因此之前未接受过EGFR-TKI治疗的晚期患者也可考虑进行检测。此类样本中超灵敏化验检测到的突变也有可能是甲醛固定引起的假阳性，因此的真突变率仍有争议。第一代EGFR-TKI治疗对肿瘤组织原发患者的临床获益较差，而第三代TKI治疗获益明显，因此之前未接受过EGFR-TKI治疗的晚期患者也可考虑进行检测。

III期临床试验结果显示，第三代EGFR-TKI奥希替尼一线治疗晚期EGFR突变患者的PFS优于标准EGFR-TKI方案（中位PFS 18.9 vs 1<@ 0.2 月）。基于此，2017年NCCN V9指南推荐奥希替尼作为EGFR突变阳性晚期患者的一线治疗药物。目前，CFDA已批准奥希替尼二线适应症用于既往治疗的晚期突变患者。基于奥希替尼在一线治疗中的优异表现，未来有望在中国上市，用于晚期患者的一线适应症。面对未来多种一、二、三代EGFR-TKI，是使用三代EGFR-TKI作为一线还是一/二代+三代EGFR-TKI序贯治疗一直是临床医生最关心的问题。在欧洲进行的纳入晚期 EGFR 突变和 EGFR-TKI 初治患者的研究将比较一线奥希替尼与吉非替尼，然后评估疾病进展后的阳性或转换三组奥希替尼患者的疗效差异，从而探索使用第三代EGFR-TKI奥希替尼的最佳时机。未来对初治患者的检测，以及治疗期间的动态检测，可能会对临床医生为患者选择最合适的治疗策略产生重大影响。

本共识制定专家组（单位名称首字母排序）：北京大学肿瘤医院病理科（林冬梅）；北京协和医院病理科（梁志勇）；福建省肿瘤医院胸肿瘤科（黄诚）；广东省人民医院（广东省医学科学院）肺癌治疗中心科（吴一龙）、肺癌研究所（张旭超）；解放军南京总医院病理科（周晓军）；上海交通大学附属胸科医院（鲁顺）肿瘤科；四川大学华西病理学系（刘卫平）；郑州大学附属肿瘤医院河南省肿瘤医院肿瘤科（马志勇）；